本研究旨在利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)，結(jié)合電子活化解離（Electron Activated Dissociation, EAD）碎裂模式，對(duì)依那西普原研藥及其生物類似藥的O-糖基化進(jìn)行深度表征。研究團(tuán)隊(duì)首先在完整蛋白水平，通過去除N-糖鏈和唾液酸，簡(jiǎn)化了樣品復(fù)雜性，鑒定了依那西普單鏈上的11個(gè)O-糖基化修飾及其主要糖型結(jié)構(gòu)（Core 1和Core 2）。其次，在糖肽水平，研究對(duì)比了CID與EAD兩種碎裂模式，證實(shí)了EAD技術(shù)在保留糖鏈完整性的同時(shí)能產(chǎn)生豐富的肽段碎片離子，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)11個(gè)O-糖基化位點(diǎn)的精準(zhǔn)定位和糖型分析。最后，研究者選取了依那西普原研藥（Y1）與來自不同制造商的6種生物類似藥或后續(xù)產(chǎn)品（Y2-Y7）進(jìn)行頭對(duì)頭比較。結(jié)果顯示，不同廠家產(chǎn)品的O-糖基化修飾存在顯著差異，其中生物類似藥Y2在解卷積質(zhì)譜、總糖基化分布及特定位點(diǎn)糖基化比例上與原研藥為相似。該研究證明了基于EAD的LC-MS方法能為復(fù)雜糖蛋白藥物的全面質(zhì)量控制和生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供詳盡且精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)支持。

本研究選取了依那西普原研藥（Y1，Enbrel^®）及6種生物類似藥或后續(xù)產(chǎn)品（Y2-Y7）作為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)主要分為完整蛋白分析與糖肽分析兩個(gè)維度。

在完整蛋白分析方面，為降低異質(zhì)性干擾，研究者使用了肽-N-糖苷酶F（PNGase F）去除N-糖鏈，并使用唾液酸酶（Sialidase）去除O-糖鏈末端的唾液酸。處理后的樣品通過ExionLC液相系統(tǒng)耦合BioZen 2.6 µm WidePore C4色譜柱進(jìn)行分離，隨后進(jìn)入SCIEX ZenoTOF^® 7600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)譜采集采用飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF MS）模式，掃描范圍為600-4000 m/z，利用Biologics Explorer軟件進(jìn)行解卷積分析。

在糖肽分析方面，樣品經(jīng)去N-糖和去唾液酸處理后，進(jìn)一步進(jìn)行變性（鹽酸胍）、還原（二硫蘇糖醇, DTT）和烷基化（碘乙酰胺, IAM）處理。隨后，采用胰蛋白酶（Trypsin）和谷氨酰基內(nèi)切酶（Glu-C）進(jìn)行聯(lián)合酶解，以獲得適宜長(zhǎng)度的肽段。LC-MS/MS分析采用Kinetex 2.6 µm C18色譜柱，在ZenoTOF^® 7600系統(tǒng)上分別使用CID和EAD模式采集數(shù)據(jù)。EAD模式的關(guān)鍵參數(shù)設(shè)定為：電子束能量7 eV，反應(yīng)時(shí)間30 ms，并開啟Zeno trap（閾值100,000 cps）以提高離子利用率和靈敏度。數(shù)據(jù)分析允許最多2個(gè)漏切位點(diǎn)，O-糖鏈搜索庫(kù)包含多達(dá)7個(gè)取代基，通過特征性的c/z離子系列確證糖基化位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)。

在完整蛋白水平，由于依那西普含有多個(gè)N-糖基化和O-糖基化位點(diǎn)，直接測(cè)定其分子量極其困難。通過酶解去除非保守的N-糖鏈和帶電荷的唾液酸后，質(zhì)譜圖譜得到了顯著簡(jiǎn)化。Biologics Explorer軟件的自動(dòng)匹配結(jié)果顯示，依那西普單鏈上主要鑒定了11個(gè)O-糖基化修飾。

原研藥（Y1）的解卷積質(zhì)譜圖顯示了一系列清晰的質(zhì)譜峰，對(duì)應(yīng)不同數(shù)量O-糖鏈的蛋白形式，質(zhì)量誤差控制在3 Da以內(nèi)。定量分析表明，含有8個(gè)和9個(gè)O-糖基化修飾的糖型是主要形式，其相對(duì)含量分別為33.77%和36.32%。通過與O-糖鏈數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確認(rèn)依那西普的主要O-糖型為Core 1（半乳糖-N-乙酰半乳糖胺）和Core 2（N-乙酰葡糖胺-半乳糖-N-乙酰半乳糖胺）結(jié)構(gòu)。

詳細(xì)的數(shù)據(jù)分析揭示了不同糖型中Core 1和Core 2的具體分布。例如，在包含8個(gè)O-糖鏈的糖型中，主要存在三種組合形式：8個(gè)Core 1、7個(gè)Core 1加1個(gè)Core 2、以及6個(gè)Core 1加2個(gè)Core 2。通過加權(quán)計(jì)算，原研藥中Core 1修飾的平均數(shù)量為8.83個(gè)，Core 2修飾的平均數(shù)量為0.34個(gè)，總O-糖基化修飾的平均數(shù)量為9.15個(gè)。這一結(jié)果表明，通過去糖基化策略，生產(chǎn)商可以在開發(fā)過程中快速、準(zhǔn)確地測(cè)定依那西普的蛋白序列和整體O-糖基化修飾水平。

圖1. 原研依那西普（Y1）的解卷積質(zhì)譜圖（A）

和各種 O-聚糖的分布（B）.

為了精準(zhǔn)定位O-糖基化位點(diǎn)并解析其微觀不均一性，研究者進(jìn)一步進(jìn)行了糖肽水平的分析，并重點(diǎn)比較了CID和EAD兩種碎裂模式的差異。

在CID模式下，以糖肽SMAPGAVHLPQPVSTR [186-201, S199 Core1]為例，質(zhì)譜圖顯示糖鏈部分的氧鎓離子（oxonium ions）豐度高，表明糖苷鍵優(yōu)先斷裂。然而，肽段骨架幾乎未發(fā)生有效碎裂，導(dǎo)致MS/MS離子的覆蓋率極低，無法準(zhǔn)確判斷具體的糖基化位點(diǎn)是S199還是T200。

相比之下，EAD碎裂模式展現(xiàn)了顯著優(yōu)勢(shì)。在相同的糖肽分析中，EAD模式下糖鏈部分保持完整，而肽段骨架優(yōu)先發(fā)生斷裂，產(chǎn)生了一系列豐富的c離子和z離子（c-ions and z-ions）。該糖肽的序列覆蓋率高達(dá)93.75%。特別是關(guān)鍵的z2和z3離子的成功檢測(cè)，明確證實(shí)了O-糖基化修飾發(fā)生于S199位點(diǎn)。這一結(jié)果有力地證明，EAD技術(shù)結(jié)合Zeno-trap的高靈敏度，不僅能保留糖鏈與肽段連接的完整性，還能提供詳盡的骨架碎片信息，是表征依那西普復(fù)雜O-糖基化的理想工具。

利用EAD模式，研究者在依那西普原研藥中成功鑒定并定位了11個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，分別為：T8、T245、S199、T200、T205、T208、S212、T213、S216、T217和S226。這與完整蛋白水平的分析結(jié)果高度一致。例如，糖肽LPAQVAFTPYAPEPGSTCR [1-19, T8 Core1]的EAD譜圖中，c8、c9、z11和z12離子的檢出精準(zhǔn)鎖定了T8為修飾位點(diǎn)。此外，盡管通常認(rèn)為CHO細(xì)胞的Core 2合酶活性較低，但在本研究的EAD分析中，明確檢測(cè)到了Core 2型糖鏈的存在，例如在T245位點(diǎn)鑒定到了Core 2結(jié)構(gòu)。這可能是由于不同制造商的細(xì)胞培養(yǎng)條件（如營(yíng)養(yǎng)濃度、pH值）差異導(dǎo)致Core 2合酶活性上調(diào)所致。

研究者進(jìn)一步對(duì)選定的5個(gè)代表性位點(diǎn)（T8、S186、S199、T200、T245）進(jìn)行了糖基化比例的定量分析。結(jié)果顯示，S199和T200位點(diǎn)在細(xì)胞表達(dá)過程中極易發(fā)生O-糖基化，其修飾比例分別高達(dá)86.45%和96.45%。相反，T8、S186和T245位點(diǎn)的修飾程度較低，Core 1修飾比例均低于5%，且未檢測(cè)到Core 2修飾（注：此處原文表述在Table 2中T245的Core 2比例顯示為N/A，但在Table 4中Y1的T245總比例為1.75%，且文中提及T245鑒定到Core 2，需結(jié)合上下文理解，可能是指特定糖肽形式或整體平均。根據(jù)Table 2數(shù)據(jù)，T245的Core 2為N/A，但Core 1為1.75%。S186的Core 2為0.25%）。三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算出的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于3%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

圖2. CID (A)和EAD (B) 碎裂模式下糖肽SMAPGAVHLPQPVSTR[186-201, S199 Core2]的

MS/MS 譜圖。

圖3. EAD模式下具有不同數(shù)量O-糖基化位點(diǎn)的糖肽MS/MS譜圖。

隨著依那西普過期，市場(chǎng)上出現(xiàn)了多種生物類似藥。本研究在完整蛋白和糖肽兩個(gè)層面對(duì)原研藥（Y1）與6種生物類似藥/后續(xù)產(chǎn)品（Y2-Y7）進(jìn)行了深入比較。

在完整蛋白水平，解卷積質(zhì)譜圖直觀地展示了各樣品的差異。生物類似藥Y2和Y3的譜圖輪廓與原研藥Y1為接近，而其他產(chǎn)品（Y4-Y7）則顯示出顯著差異。從O-糖鏈總數(shù)的分布來看，Y2和Y3分別主要含有6-10個(gè)和6-11個(gè)O-糖鏈，與Y1（6-11個(gè)）范圍重疊度高。在平均修飾數(shù)量上，Y2與原研藥為相似，其Core 1平均數(shù)量為7.11（Y1為7.47），Core 2平均數(shù)量為1.16（Y1為1.02），總平均數(shù)量為8.27（Y1為8.49）。相比之下，Y3雖然總糖鏈數(shù)分布相似，但其Core 2修飾的平均數(shù)量高達(dá)2.82，顯著高于原研藥，導(dǎo)致總平均糖基化數(shù)達(dá)到10.63。Y4-Y7樣品的總糖基化水平普遍較低（約6.6-6.9），且Core 1與Core 2的比例分布與原研藥存在較大偏差，例如Y4和Y7的Core 1與Core 2數(shù)量相當(dāng)，而Y5和Y6的Core 1數(shù)量明顯多于Core 2。

在糖肽水平，研究者對(duì)比了5個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)（T8、S186、S199、T200、T245）的糖基化比例，結(jié)果進(jìn)一步印證了完整蛋白水平的發(fā)現(xiàn)。生物類似藥Y2在所有5個(gè)位點(diǎn)的糖基化比例上均與原研藥Y1高度一致：T8（4.75% vs 4.56%）、S186（0.66% vs 0.59%）、S199（88.16% vs 86.45%）、T200（96.25% vs 96.45%）和T245（1.52% vs 1.75%）。這表明Y2在分子結(jié)構(gòu)上與原研藥高度相似。然而，其他樣品表現(xiàn)出顯著的特異性差異。例如，Y3、Y4、Y5和Y6在T8位點(diǎn)的糖基化比例異常升高，接近100%（Y3為100%，Y4為99.17%），而原研藥僅為4.56%。此外，Y4在S199和T200位點(diǎn)的糖基化比例顯著降低（分別為29.84%和70.75%），遠(yuǎn)低于原研藥水平。Y3、Y4、Y6和Y7在T245位點(diǎn)的糖基化比例也大幅升高至24%-27%左右，而原研藥僅為1.75%。

這些數(shù)據(jù)充分說明，不同制造商生產(chǎn)的依那西普在O-糖基化修飾上存在顯著差異。這些差異源于生產(chǎn)工藝的不同，如宿主細(xì)胞選擇、培養(yǎng)條件及純化工藝等。特別是Core 2結(jié)構(gòu)的差異可能影響TNF受體結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，進(jìn)而影響藥物與TNF-α的結(jié)合親和力及治療效果；而過量的Core 2修飾甚至可能作為外以此抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別，增加藥物的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。因此，Y2被認(rèn)為是與原研藥在O-糖基化方面最相似的生物類似藥，而Y3-Y7的安全性與免疫原性需在臨床研究中進(jìn)一步評(píng)估。

圖4. 通過 LC-MS 分析獲得的完整蛋白水平依那西普原研藥（Y1）和 6 種生物類似藥（Y2-Y7）的解卷積質(zhì)譜圖.

本研究創(chuàng)新性地采用LC-MS結(jié)合EAD碎裂技術(shù)，對(duì)依那西普及其生物類似藥的O-糖基化進(jìn)行了全面的深度表征。

首先，研究建立了一套高效的分析流程。通過酶解去除N-糖和唾液酸，成功在完整蛋白水平測(cè)定了依那西普的分子量分布，鑒定了11個(gè)O-糖基化位點(diǎn)及Core 1/Core 2兩種主要糖型，并計(jì)算了其平均糖基化數(shù)量（Core 1為8.83，Core 2為0.34）。

其次，研究深入比較了CID與EAD技術(shù)在糖肽分析中的表現(xiàn)，確立了EAD技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。結(jié)果表明，EAD模式能有效克服CID模式下糖苷鍵優(yōu)先斷裂的局限，在保留糖鏈完整性的同時(shí)產(chǎn)生豐富的肽段骨架離子（c/z離子），極大提高了序列覆蓋率，實(shí)現(xiàn)了對(duì)O-糖基化位點(diǎn)的精準(zhǔn)定位和糖型的定性定量分析。利用該技術(shù)，研究者在單次進(jìn)樣中成功鑒定了依那西普單鏈上的11個(gè)具體O-糖基化位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)S199和T200是高頻修飾位點(diǎn)。

最后，本研究首利用EAD技術(shù)對(duì)依那西普原研藥與多種生物類似藥進(jìn)行了系統(tǒng)的O-糖基化比對(duì)。綜合解卷積譜圖一致性、總O-糖基化分布及糖肽位點(diǎn)特異性比例，研究確認(rèn)生物類似藥Y2與原研藥Y1為相似。相比之下，其他生物類似藥或后續(xù)產(chǎn)品在糖基化程度和糖型分布上表現(xiàn)出顯著的工藝相關(guān)性差異。鑒于O-糖基化異質(zhì)性對(duì)藥物療效和免疫原性的潛在影響，這種深度的表征分析對(duì)于生物類似藥的相似性評(píng)價(jià)至關(guān)重要。